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产品说明/Specification Sheet
产品名称: | G-418 sulfate [Geneticin] | ||||
产品编号: | GE859-250MG | 规格: | 250MG | 价格: | ¥110 |
产品类别: | 生化试剂 | CAS#: | 108321-42-2 | ||
品牌: | coolaber | 级别: | 抗生素 | ||
分子式: | C20H40N4O10·2H2SO4 | 分子量: | 692.7 | ||
危险品: | NO | 危险品系数: | |||
储存条件: | 2-8°C | 说明书: |
产品属性:
产品简介
G418 Sulfate(G418硫酸盐)也称作Geneticin(遗传霉素)是一种结构类似于庆大霉素B1(Gentamycin B1) 的氨基糖苷类抗生素,通过影响80S核糖体功能和阻断延伸步骤来干扰蛋白合成,对原核和真核等细胞都有毒性,包括细菌、酵母、高等植物和哺乳动物细胞,也包括原生动物和蠕虫。其抗性基因(主要为neo基因)位于转座子Tn601(903)或Tn5(来源于细菌),但是可以在真核细胞中表达。通过基因重组技术将这些抗性基因导入细胞,使其获得对G418的耐药性,从而用来筛选和维持培养携带抗性基因的原核或者真核细胞。
哺乳动物细胞中,当抗性基因neo被整合进真核细胞基因组后,使其编码表达氨基糖苷磷酸转移酶(amino-glycoside 3’-phosphotransferase,APH(3)II)。此酶通过共价修饰G418的氨基或羟基功能,抑制抗生素-核糖体间的相互作用,从而使得抗生素失活。这一特性赋予细胞产生抗性。稳转细胞株筛选实验,需要建立杀灭曲线(剂量反应曲线)确定杀死无抗性细胞的最低有效浓度。
3.杀灭曲线的建立 通常情况,哺乳动物细胞筛选范围200-2000 μg/mL;植物细胞:10-100 μg/mL;酵母细胞:500-1000 μg/mL。 为了筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞株,需要确定能够杀死未转染宿主细胞的抗生素最低浓度,可通过建立杀灭曲线(剂量反应曲线)来实现,至少选择6个浓度。处理分裂期的细胞时G418的活性最强,因此在添加G418之前需要让细胞培养一段时间。 1、按照20-25%的细胞密度将未转化的细胞铺在合适的培养板上,37℃,CO2过夜培养(需要更高密度,可增加接种量)。 2、根据细胞类型,设定合适的浓度梯度。以哺乳动物细胞为例,可设定50,100,250,500,750,1000μg/mL。 3、第2天换用新鲜配制的含有相应浓度药物的培养基,每个浓度做三个平行孔。 4、接下来每3-4天更换新的含药物培养基。 5、按照每2天进行活细胞计数,来确定杀灭未转染细胞的恰当浓度。通常7-10天内能够杀死绝大多数细胞的最低浓度为筛选用的工作浓度。 稳定转染细胞的筛选 1、转染48 h后,用含有适当浓度的G418筛选培养基来传代细胞(直接传代或者稀释后传代)。 注:细胞处于活跃分裂状态时抗生素的杀伤效果最好。则当细胞过于稠密,其效率会降低,最好将细胞稀释至丰度低于25%。 2、每隔3-4天更换含有药物的筛选培养液。 3、筛选7天后观察并评估细胞克隆(集落)的形成情况。集落的形成可能还需要一周或者更多的时间,这取决于宿主细胞类型,转染,以及筛选效果。 4、挑取并转移5-10个抗性克隆于35 mm细胞培养板,继续用含药物的筛选培养液维持培养7天。 5、后续更换正常培养基培养即可。 注意事项 1、G418不可高压灭菌; 2、G418不要和其他的抗生素/抗真菌剂(如青霉素/链霉素)共同使用,因为它们是G418的竞争性抑制剂。其它的抗生素会产生交叉活性。 3、配制G418溶液时,要换算不同批次G418的活力值(potency),从而得到需要活性浓度的储存液以及工作液。 4、加入G418的培养体系,未转染的细胞未被杀死,可能因为药物浓度过低,或者细胞密度过高。快速分裂的细胞相对于缓慢增殖细胞,更容易被杀死。添加抗生素5-7天后可能才会杀死对照细胞(未转染),转染细胞(抗性克隆子)的克隆需要10-14天形成。 5、加入致死剂量的G418,细胞可能还会继续分裂2-3次。G418的药效通常在2天后才变得明显。 6、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。 |
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